Konstrukcija i testiranje vektora sa sekvencom za nestabilnu rekombinazu Cre

master's thesis

• Title (english): Construction and testing of a vector with a sequence fo a non-stable Cre recombinase
• Author: Barbara Skender
• Mentor: Maja Matulić (mentor)
• Committee member: Maja Matulić (predsjednik povjerenstva)
• Committee member: Petar Kružić (član povjerenstva)
• Committee member: Vesna Benković (član povjerenstva)
• Committee member: Jasna Hrenović (član povjerenstva)
• Granter: University of Zagreb; Faculty of Science; (Department of Biology); Zagreb
• Defense date and country: 2015-02-25, Croatia
• Scientific / art field, discipline and subdiscipline: NATURAL SCIENCES; Biology

Abstract

Praćenje staničnih linija metoda je u embriologiji koja omogućava identifikaciju potomaka/progenitora nastalih diobom određene stanice tijekom embrionalnog razvoja. Metoda koja se često koristi pri genetičkom praćenju stanica upotreba je rekombinacijskog sustava Cre/loxP koji omogućava promjene ciljnog gena i unos biljega u stanicu. Rekombinaza Cre ima veliku aktivnost te njezinim unošenjem u stanice često dolazi do spontane aktivacije sustava Cre/loxP. Posljedica toga je otežano praćenje stanica od interesa. Regulacijom aktivnosti rekombinaze Cre povećala bi se specifičnost metode praćenja
staničnih linija. Cilj ovog istraživanja bio je konstrukcija vektora koji kodira nestabilni oblik rekombinaze Cre koja bi, zbog specifične sekvence PEST, imala kratak poluživot, te analiza njezinih sposobnosti rekombinacije. Destabilizacija rekombinaze Cre postigla se ugradnjom sekvence PEST u vektor pCS2+ mCherry-T2A- CreERT2 putem ligacije. Fuzijski proteini kodirani ovim plazmidom imaju sposobnost aktivacije rekombinacije u ovisnosti o dodatku intuktora tamoksifena, kod optimalnih koncentracija. Različite koncentracije mRNA za destabiliziranu i stabilnu rekombinazu usporedno su se mikroinjicirale u jednostanične embrije riba zebrica (Danio rerio) da bi se našla optimalna koncentracija pri kojoj je sustav Cre/loxP inducibilan dodavanjem tamoksifena. Rezultati su pokazali pojavu rekombinacije inducirane tamoksifenom u embriju u koji je injektirana mRNA sa sekvencom za stabilnu rekombinazu Cre koncentracije 0,5 pg/μL. Nije uočena razlika u učinkovitosti rekombinacije između stabilne i destabilizirane rekombinaze Cre. Kako bi se potvrdili ovi rezultati, potrebno je provesti dodatna istraživanja u području rubnih koncentracija pri kojima se rekombinacija odvija (5 – 0,5pg /μL).

Abstract (english)

The method of lineage tracing in embryology enables identification of cell’s progeny during embryonic development. Method often used in genetic lineage tracing is the use of Cre/loxP recombination system which enables changes in the target gene and introduction of marker gene into the cell. Cre recombinase has high activity and its insertion into cells often leads to spontaneous activation. Consequently, cell tracking is hindered under these conditions. Restriction of activity of Cre recombinase would increase the specificity of the lineage tracing method. The aim of this study was the construction of a vector coding for non – stable Cre recombinas and analysis of its recombination ability. Destabilization of Cre recombinase would be achieved by ligation of PEST sequence, responsible for short half-life of proteins to Cre sequence in pCS2+mCherry-T2A-Cre ERT2 vector . Fusion proteins obtained from this vector have the ability to induce recombination in dependence on addition of tamoxifen, under optimal concentration. Different concentrations of mRNA for stable and destabilised recombinase were in parallel microinjected in one-cell zebrafish embryos (Danio rerio) to optimize concentrations under which Cre/loxP system is inducible by adding tamoxifen. Results shown the appearance of tamoxifen induced recombination in embryo injected with 0,5 pg/μL mRNA for a stable Cre recombinase. There was no difference in effectiveness of recombination between stable and a non - stable recombinase Cre. In order to confirm these results it is necessary to conduct additional testing border concentrations of Cre mRNA in which recombination is inducible (5 – 0,5pg/μl).

• Keywords: riba zebrica; PEST; Cre/loxP; tamoksifen; praćenje stanica
• Keywords (english): zebrafish; PEST; Cre/loxP; Tamoxifen; lineage tracing
• Language: croatian
• URN:NBN: urn:nbn:hr:217:905440
• Study programme: Title: Experimental Biology; Study programme type: university; Study level: graduate; Academic / professional title: magistar/magistra eksperimentalne biologije (magistar/magistra eksperimentalne biologije)
• Type of resource: Text
• File origin: Born digital
• Access conditions: Open access
• Created on: 2017-04-24 08:34:43