Uspostava ljudskih staničnih linija s endogeno eksprimiranim proteinom tubulinom fluorescentno obilježenim metodom CRISPaint

diplomski rad

• Naslov (engleski): Establishment of human cell lines with endogenous expression of protein tubulin fluorescently tagged using the CRISPaint method
• Autor: Erna Tintor
• Mentor: Iva Marija Tolić (mentor)
• Mentor: Maja Matulić (komentor)
• Član povjerenstva: Maja Matulić (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Biljana Balen (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Petra Peharec Štefanić (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Tomislav Ivanković (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prirodoslovno-matematički fakultet; (Biološki odsjek); Zagreb
• Datum i država obrane: 2023-02-21, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: PRIRODNE ZNANOSTI; Biologija

Sažetak

Za promatranje procesa unutar žive stanice, većinom se koristi fluorescencijska mikroskopija.
Glavni zahtjev fluorescencijske mikroskopije je to da željeni predmet proučavanja u stanici
mora fluorescirati. Jedan od načina za promatranje stanice pod fluorescencijskim mikroskopom
je da se stanični proteini obilježe fluorescentnim proteinima. Međutim, egzogeno unešene
sekvence za fuzionirane proteine generiraju proteine s neprirodnom razinom ekspresije, a
endogeni protein ostaje neobilježen. Endogeno obilježavanje staničnih proteina s
fluorescentnim proteinima jedan je od načina za njihovu vizualizaciju bez utjecaja na jačinu
ekspresije. Tehnologija CRISPR-Cas (engl. Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats) često je korištena u genetičkom inženjerstvu za jednostavno i precizno
uređivanje genoma. U ovom radu je korištena novo razvijena metoda CRISPaint (engl.
CRISPR-assisted insertion tagging). To je sustav koji uz pomoć tehnologije CRISPR-Cas
omogućava ugradnju gena za fluorescentni protein u genom tj. u ciljanu sekvencu gena, da bi
se proizveo endogeni protein obilježeni fluorescentnim biljegom. Optimizirala sam protokol za
transfekciju uz pomoć plazmida sustava CRISPaint-a i uspostavila sam dvije ljudske stanične
linije, HeLa i RPE1, s endogeno obilježenim proteinom tubulinom sa zelenim fluorescentnim
proteinom. Ove stanične linije se dalje mogu koristiti za promatranje stanične diobe pod
fluorescencijskim mikroskopom, a metoda CRISPaint se može primijeniti za endogeno
obilježavanje i drugih proteina od interesa.

Sažetak (engleski)

Fluorescence microscopy is used to observe processes inside a living cell and its main
requirement is that the desired object of study in the cell must fluoresce. One way to observe a
cell under a fluorescence microscope is to label cellular proteins with fluorescent proteins (FP).
However, exogenously introduced sequences for fusion proteins produce proteins with
unnatural expression levels while the endogenous protein remains unlabeled. Endogenous
labeling of cellular proteins with FP is one way to visualize them without affecting the strength
of expression. CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
technology is today often used in genetic engineering to simply and precisely edit the genome.
In this work, the newly developed method CRISPaint (CRISPR-assisted insertion tagging) was
used. It is a system that, using CRISPR-Cas technology, enables the incorporation of a gene for
FP into the genome in order to produce an endogenous fluorescently tagged protein. I optimized
the transfection protocol using CRISPaint system plasmids and established two human cell
lines, HeLa and RPE1, with endogenously labeled protein tubulin with green FP. These cell
lines can be used to observe cell division under a fluorescence microscope and the CRISPaint
method can be applied for endogenous labeling of other proteins.

• Ključne riječi: HeLa; RPE1; diobeno vreteno; GFP; konfokalna mikroskopija
• Ključne riječi (engleski): HeLa; RPE1; mitotic spindle; GFP; confocal microscopy
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:217:941693
• Studijski program: Naziv: Molekularna biologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra molekularne biologije (mag. biol. mol.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Rad dostupan nakon; Datum isteka embarga: 2025-02-21
• Datum i vrijeme pohrane: 2023-03-01 13:21:21