Konstrukcija i validacija vektora za ekspresiju represorskog oblika proteina GLI3 u stanicama čovjeka

diplomski rad

• Naslov (engleski): Construction and validation of the expression vector for the repressor form of the GLI3 protein in human cells
• Autor: Lucija Brtan
• Mentor: Maja Sabol (mentor)
• Član povjerenstva: Morana Dulić (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Željka Soldin (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Iva Juranović Cindrić (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Marko Močibob (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prirodoslovno-matematički fakultet; (Kemijski odsjek); Zagreb
• Datum i država obrane: 2023-02-16, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: PRIRODNE ZNANOSTI; Kemija

Sažetak

Proteini GLI važni su sudionici signalnog puta Hedgehog-GLI čiji se razni poremećaji u
signalizaciji povezuju se s razvojnim deformacijama te onkološkim oboljenjima. U fokusu ovog
rada nalazi se protein GLI3, jedan od tri izoforme proteina GLI. Protein GLI3 u svom punom
obliku (GLI3FL) ima ulogu transkripcijskog aktivatora, dok njegov C-terminalni skraćeni oblik
ima ulogu represora (GLI3R). Cilj ovog istraživanja je razvitak in vitro alata za ispitivanje
različitih funkcija GLI3FL i GLI3R u tumorskim stanicama. Konstruiran je vektor za ekspresiju
GLI3R, a njegova validacija izvršena je na staničnim linijama s različitom proteinskom
ekspresijom proteina GLI3. Uvjeti transfekcije su optimizirani na staničnoj liniji fibroblasta
prostate WPMY-1 s niskom razinom ekspresije, a efekt transfekcije ispitan je na staničnoj liniji
metastatskog melanoma A375 s visokom razinom ekspresije, te uspoređen s djelovanjem
spojeva koji mijenjaju omjere GLI3FL/GLI3R. Nakon transfekcije staničnih linija, analizom
po Westernu dokazana je povećana ekspresija proteina GLI3R, a RT-qPCR metodom je
potvrđena povećana ekspresija gena GLI3. Imunofluorescencijskom metodom proteini GLI3 su
lokalizirani u citoplazmi te u jezgri stanica.

Sažetak (engleski)

GLI proteins are essential members of the Hedgehog-GLI signaling pathway, and aberrations
in which are associated with developmental deformities and oncological diseases. This thesis
focuses on the GLI3 protein, one of the three isoforms of GLI proteins. The GLI3 protein in its
full form (GLI3FL) has the role of a transcriptional activator, while its C-terminal shortened
form has the repressor effect (GLI3R). This research aims to develop an in vitro tool for testing
the different functions of GLI3FL and GLI3R in tumor cells. A GLI3R expression vector was
constructed and validated on cell lines with different basal expression of the GLI3 protein. The
transfection conditions were optimized on the low-expressing WPMY-1 cell line, and the
transfection effect was tested on the high-expressing A375 cell line, and compared with the
effect of compounds which affect the GLI3FL/GLI3R ratio. After the transfection of the cell
lines, increased protein expression of GLI3R was demonstrated by the Western blot, and
increased gene expression of GLI3 was confirmed by the RT-qPCR method. GLI3 proteins
were localized in the cytoplasm and the cell nucleus using immunofluorescent staining.

• Ključne riječi: protein GLI3; kloniranje; PTCH1; signalni put HH-GLI; transfekcija
• Ključne riječi (engleski): GLI3 protein; cloning; PTCH1; HH-GLI signaling pathway; transfection
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:217:079669
• Projekt: Šifra: IP-2018-01-4889; Naziv: Regulacija GLI koda u tumorima ovisnim o BRAF/NRAS mutacijama; Kratica: GLIcode; Voditelj: Maja Sabol; Pravna nadležnost: Hrvatska; Financijer: HRZZ; Linija financiranja: IP
• Studijski program: Naziv: Kemija; smjerovi: istraživački; Smjer: istraživački; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra kemije (mag. chem.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup
• Datum i vrijeme pohrane: 2023-03-22 13:34:08