Konstrukcija modularnog sustava višestrukih sgRNA za istovremeno ciljanje nekoliko lokusa tehnologijom CRISPR-Cas9

diplomski rad

• Naslov (engleski): Construction of a modular system for multiple guide RNA cloning for simultaneous targeting of several loci using the CRISPR-Cas9 technology
• Autor: Lucija Jukić
• Mentor: Aleksandar Vojta (mentor)
• Član povjerenstva: Aleksandar Vojta (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Zlatko Liber (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Marin Ježić (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Nenad Malenica (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prirodoslovno-matematički fakultet; (Biološki odsjek); Zagreb
• Datum i država obrane: 2018-02-28, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: PRIRODNE ZNANOSTI; Biologija

Sažetak

Sustav CRISPR-Cas9 sastoji se od dvije osnovne komponente, proteina Cas9 i molekule single guide RNA (sgRNA). Protein Cas9 je endonukleaza koja stvara dvolančani lom u molekuli DNA na temelju komplementarnosti ciljane sekvence s molekulom sgRNA. Fuzijom inaktiviranog proteina Cas9 (dCas9) na katalitičku domenu efektorskog proteina omogućeno je ciljano modificiranje epigenoma bez da nastaje dvolančani lom u molekuli DNA. Istovremenom ekspresijom većeg broja sgRNA i proteina Cas9 u eukariotskoj stanici moguće je ciljati veći broj lokusa odjednom. Plazmidni vektor za ekspresiju proteina dCas9 i više molekula sgRNA različite specifičnosti može se sintetizirati u tehnički jednostavnoj reakciji kloniranjem Golden Gate metodom, koja se temelji na restrikcijskim enzimima tipa IIS koji cijepaju sekvencu izvan mjesta prepoznavanja što omogućava vrlo precizno spajanje većeg broja odsječaka DNA. Cilj ovog istraživanja bio je proširiti sustav CRISPR-Cas9 molekularnim alatima za povezivanje više molekula sgRNA u jedan vektor koristeći enzime Golden Gate sustava te provjeriti njihovo slaganje u Golden Gate sustavu. Uspješno su konstruirani plazmidni vektori s kompatibilnim kohezivnim krajevima dobivenim cijepanjem enzimima Golden Gate sustava, kao i odgovarajući vektori za ugradnju do šest modula sgRNA u okosnicu za transfekciju i koekspresiju fuzijskog proteina dCas9-DNMT3A. Pravilno sklapanje molekularnog alata provjereno je restrikcijskom analizom i/ili lančanom reakcijom polimeraze. Izrada takvog fleksibilnog sustava olakšava modificiranje genoma ili epigenoma proširivanjem postojećeg skupa molekularnih alata s mogućnošću ciljanja do šest lokusa istovremeno.

Sažetak (engleski)

CRISPR-Cas9 system is comprised of two main components, Cas9 protein and single guide RNA (sgRNA). The Cas9 protein is an endonuclease that catalyzes site-specific cleavage of double stranded DNA and is guided by an sgRNA molecule that is complementary to the DNA target site. Inactivated protein Cas9 (dCas9) fused to a catalytic domain of an effector protein enables epigenome editing without inducing double strand break. Several genomic loci can be targeted simultaneously by co-expression of protein Cas9 and multiple sgRNA molecules in eukaryotic cells. Plasmid vector for co-expression of protein Cas9 and multiple sgRNA molecules can be constructed using Type IIS restriction enzymes of the Golden Gate system, which cleave outside of their recognition sequence and thereby enable precise assembly of multiple DNA fragments. The aim of this study was to expand the CRISPR-Cas9 system with molecular tools for multiple sgRNA cloning using the Golden Gate enzymes and to confirm their successful assembly in the Golden Gate system. Specific plasmid vectors with compatible cohesive ends created by Golden gate enzymes were successfully assembled, and so were the corresponding vectors for incorporation of six sgRNA modules in plasmid for transfection and co-expression of fusion protein dCas9-DNMT3A. Plasmid constructs were verified by two methods: restriction enzyme analysis and polymerase chain reaction (PCR). Construction of this flexible system facilitates genome and epigenome editing by expansion of the existing set of molecular tools with the possibility of simultaneously targeting up to six loci.

• Ključne riječi: metoda Golden Gate; DNMT3A; plazmidni vektor; sgRNA
• Ključne riječi (engleski): Golden Gate method; DNMT3A; plasmid vector; sgRNA
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:217:234520
• Studijski program: Naziv: Molekularna biologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra molekularne biologije (mag. biol. mol.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup; Datum isteka embarga: 2020-02-28
• Datum i vrijeme pohrane: 2018-05-04 11:42:36