| Sažetak (hrvatski) | Obitelj MATH-BTB sastoji se od proteina koji sadrže dvije domene, MATH (Meprin and
TRAF Homology) i BTB (Broad-complex, Tramtrack, and Bric-à-brac). U genomima gotovo svih
eukariota, velik broj gena sadrži funkcionalni slijed koji kodira ili domenu MATH ili domenu BTB
uz barem jednu drugu domenu. Proteini koji sadrže domenu BTB svrstani su u dvije glavne
skupine: oni koji sudjeluju u proteinskim interakcijama posredovanim domenom BTB i oni koji
vežu DNA kako bi regulirali transkripciju (Stogios i sur., 2005). Svi dosad istraženi proteini koji
sadrže domenu MATH uključeni su u regulaciju obrade proteina (Zapata i sur., 2007). Proteini iz
podskupine MATH-BTB, koji sadrže i MATH i BTB domenu, opisani su kao adapteri kompleksa
ubikvitin ligaze E3 zasnovane na proteinu Cullin 3 (CUL3). Ovaj tip ligaze E3 (u daljnjem tekstu:
ligaza CUL3-E3) sudjeluje u proteasomskoj razgradnji ciljnih proteina. Kompleks ligaze CUL3-
E3 čini protein osovine CUL3 koji s jedne strane veže protein RING-BOX1 (RBX1) i preko njega
ubikvitin ligazu E2, a s druge strane veže domenu BTB proteina adaptera. Protein adapter svojom
domenom MATH veže ciljni protein, i time ga dovodi u neposrednu blizinu ligaze E2 koja ga
obilježava poliubikvitinskim lancem i time ga usmjerava u razgradnju na proteasomu 26S (Chen i
sur., 2013, Gingerich i sur., 2005, Juranić i sur., 2012, Stogios i sur., 2005., između ostalih).
Najranije opisan životinjski protein iz obitelji MATH-BTB je protein MATERNAL EFFECT
LETHAL-26 (MEL-26) iz oblića Caenorhabditis elegans. MEL-26 je adapter ligaze E3 koji
posreduje u razgradnji proteina MEI-1, proteina iz skupine katanina s ulogom cijepanja
mikrotubula. Ovaj proces odvija se nakon mejoze i ključan je za sastavljanje mitotičkog vretena
(Pintard i sur., 2004). Proteini MATH-BTB široko su zastupljeni i u biljkama, no detaljno je
proučeno samo nekoliko članova. Filogenetička analiza gena MATH-BTB u dvosupnici talijinom
uročnjaku (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh) i jednosupnici riži (Oryza sativa L.) pokazala je da
geni MATH-BTB grupiraju u dvije skupine: manju, evolucijski očuvaniju osnovnu skupinu i veću,
proširenu skupinu (Gingerich i sur., 2005). Uključivanje više kopnenih biljnih vrsta u filogenetičku
analizu potvrdilo je razdvajanje biljnih gena MATH-BTB u dvije skupine, uz dodatno grupiranje
gena iz proširene skupine u pet manjih podskupina, nazvanih E1 do E5 (Gingerich i sur., 2007;
Juranić i Dresselhaus, 2014). Dok genom uročnjaka kodira samo šest gena MATH-BTB (AtBPM1-
6), koji grupiraju u osnovnu skupinu (Gingerich i sur. 2005; 2007; Juranić i Dresselhaus, 2014),
evoluciju trava (porodica Poaceae) obilježila je velika ekspanzija gena MATH-BTB, koji specifično
grupiraju u proširenu skupinu (Gingerich i sur., 2007; Juranić i Dresselhaus, 2014). Do sada je opisano nekoliko biljnih proteina MATH-BTB. Jedan od njih je protein ZmMAB1
kukuruza (Zea mays L.), protein iz proširene skupine eksprimiran u muškom i ženskom gametofitu
(Juranić i sur., 2012). Istraživanje mutanata sa smanjenom ekspresijom gena ZmMAB1 pokazalo je
da protein ZmMAB1 ima ulogu u pozicioniranju jezgara tijekom prijelaza iz mitoze u mejozu u
muškom i ženskom gametofitu, kao i u formiranju i funkciji diobenog vretena tijekom mejoze
(Juranić i sur., 2012). Proučena su i dva gena MATH-BTB pšenice (Triticum aestivum L.). Dok je
TaMAB1 eksprimiran isključivo u jajnim stanicama pšenice, TaMAB2 je eksprimiran u zigoti i u
dvostaničnom proembriju (Leljak-Levanić i sur., 2013). Prekomjerna ekspresija rekombinantnog
proteina TaMAB2 obilježenog zelenim fluorescentnim proteinom (eng. green fluorescent protein,
GFP) u stanicama duhana BY2, rezultirala je lokalizacijom proteina TaMAB2 u jezgri i oko nje
(Leljak-Levanić i sur., 2013).
Obitelj proteina MATH-BTB uročnjaka (nadalje BPM) detaljnije je proučena. Djelujući kao
adapteri ligaza CUL3-E3 specifični za vezanje supstrata, proteini BPM posreduju u razgradnji
različitih transkripcijskih faktora, te stoga djeluju kao regulatori različitih razvojnih procesa i
odgovora na stres. Primjerice, proteini BPM povezani su s regulacijom odgovora na hormon
abscizinsku kiselinu (ABA), ključnog mehanizma odgovora biljke na biotski i abiotski stres.
Proteini BPM potiču razgradnju transkripcijskog faktora ATHB6 iz obitelji leucinskih zatvarača
(eng. homeodomain-leucine zipper; HD-ZIP), koji koči signalni put hormona ABA (Himmelbach
i sur., 2002). Proteini BPM, potičući njegovu razgradnju, promoviraju signalni put hormona ABA
(Lechner i sur., 2011). Nadalje, proteini BPM3 i BPM5 potiču razgradnju protein fosfataza tipa 2C
(PP2C), negativnih regulatora signalnog puta hormona ABA, čime reguliraju količinu raspoloživih
proteina PP2C tijekom odgovora na stres (Julian i sur., 2019). Proteini BPM uključeni su i u
regulaciju cvjetanja, potičući razgradnju transkripcijskog faktora MYB56 iz porodice R2R3-MYB,
koji smanjuje ekspresiju gena FLOWERING LOCUS T (FT), ključnog aktivatora cvatnje u
uročnjaku (Chen i sur., 2015). Proteini BPM također su povezani s reakcijom na etilen i to putem
interakcije s transkripcijskim faktorima iz obitelji Apetala2/ethylene response factor (AP2/ERF).
Primjerice, proteini BPM destabiliziraju transkripcijski faktor WRINKLED 1 (WRI1) te tako
utječu na metabolizam masnih kiselina i razvoj sjemena u uročnjaku (Chen i sur., 2013). Nedavno
je još jedan član obitelji AP2/ERF povezan s proteinima BPM, krovni transkripcijski faktor
DEHYDRATION-RESPONSIVE ELEMENT BINDING 2A (DREB2A) uključen u odgovor na
sušu i toplinski stres u uročnjaku. DREB2A potiče ekspresiju mnogih gena osjetljivih na sušu i
toplinski stres, a i ekspresija gena DREB2A inducirana je stresom (Sakuma i sur., 2006a; 2006b).
Proteini BPM stupaju u interakciju s DREB2A i potiču njegovu razgradnju putem aktivnosti
CUL3-E3 ligaze, čime reguliraju količinu raspoloživog proteina DREB2A u uvjetima stresa
(Morimoto i sur., 2017).
Prvi cilj ovog rada bila je filogenetička analiza proteina MATH-BTB pšenice i uročnjaka.
Radi dobivanja uvida u evolucijsku povijest proteina pšenice iz obitelji MATH-BTB, temeljem
aminokiselinske sekvence proteina TaMAB2 pretražen je genom pšenice u bazi podataka Ensembl
Plants. Ovom pretragom dobivena je lista od 46 gena MATH-BTB, anotiranih kao TaMAB1-46 u
skladu s nomenklaturom predloženom za gene TaMAB1-2 (Triticum aestivum MATH-BTB;
Leljak-Levanić et al., 2013). Aminokiselinske sekvence proteina TaMAB pretražene su u bazi
podataka NCBI radi provjere prisutnosti evolucijski očuvanih domena MATH i BTB, prema
bazama Protein family (Pfam) i Conserved Domains (CD). Za svih 46 proteina predviđeno je
postojanje barem jedne domene MATH i jedne domene BTB, dok protein TaMAB46 sadrži po
dvije kopije domena MATH i BTB. Ovaj rezultat ukazuje na veliku ekspanziju gena MATH-BTB
pšenice, što je u skladu s postojećim podacima o ekspanziji obitelji MATH-BTB u drugim vrstama
trava, kao što su riža, kukuruz, Sorghum bicolor i Brachypodium dystachion (Gingerich i sur.,
2007; Juranić i Dresselhaus, 2014). Iz baze Ensembl Plants preuzeti su podaci o postojanju varijanti
alternativnog prekrajanja RNA (eng. splicing variants) i broju egzona u kodirajućoj regiji. Dok
većina gena TaMAB kodira za jednu RNA, četiri gena TaMAB kodiraju po dvije alternativne
varijante prekrajanja. Najveći broj gena TaMAB sadrži jedan ili dva egzona, dok manji broj gena
sadrži tri, četiri, pet ili, u jednom slučaju, osam egzona u kodirajućoj regiji.
Nadalje, provedena je filogenetička analiza identificiranih proteina MATH-BTB pšenice, zajedno
s proteinima MATH-BTB kukuruza (Juranić i sur., 2012), riže (Gingerich i sur., 2007.) i uročnjaka
(Gingerich i sur., 2005; 2007). Metodom maksimalne vjerojatnosti utvrđeno je grupiranje proteina
MATH-BTB u dvije skupine, osnovnu i proširenu, uz dodatno razdvajanje gena proširene skupine
u pet podskupina, nazvanih E1 do E5, prateći nomenklaturu iz Juranić i Dresselhaus (2014). Dok
je svih šest gena uročnjaka grupiralo u osnovnu skupinu, većina gena pšenice grupirala je u
proširenu skupinu, što je u skladu s dosadašnjim saznanjima da je proširena skupina specifična za
gene MATH-BTB trava (Juranić i Dresselhaus, 2014). Samo četiri proteina MATH-BTB pšenice
grupirala su u osnovnu skupinu, i oni sadrže po četiri ili pet egzona, što je najčešći broj egzona
gena BPM uročnjaka. Protein TaMAB2 grupirao je u podskupinu E3 proširene skupine.
S ciljem provjere evolucijske očuvanosti domena MATH i BTB u osnovnoj i proširenoj skupini, iz
baza Pfam i CD preuzete su sekvence navedenih domena svih proteina pšenice proširene skupine,
kao i svih proteina pšenice, kukuruza, riže i uročnjaka iz osnovne skupine. Višestruko sravnjenje
sljedova pokazalo je manju očuvanost domene MATH proširene skupine u odnosu na domenu
BTB, dok je u osnovnoj skupini domena MATH očuvanija od domene BTB. Ovaj rezultat u skladu
je s postojećim indicijama o pojačanoj diverzifikaciji domene MATH proširene skupine, za koju
se smatra da je posljedica diverzifikacije supstrata proteina MATH-BTB kao adaptera CUL3-E3
ligaze (Gingerich i sur., 2007) te je vezana uz okolišne čimbenike koji su specifično oblikovali
obitelj MATH-BTB vrsta iz porodice trava (Juranić i Dresselhaus, 2014).
Drugi cilj ovog rada bio je istražiti funkcije dvaju predstavnika obitelji MATH-BTB, proteina
pšenice iz proširene skupine, TaMAB2, i proteina uročnjaka iz osnovne skupine, AtBPM1 (nadalje
BPM1). Budući da utišavanje gena TaMAB2 u pšenici dovodi do letalnog fenotipa (Bauer i sur.,
2019), za istraživanje fizioloških uloga proteina TaMAB2 nije bilo moguće koristiti homologni
sustav. Stoga je za indirektno istraživanje funkcije proteina TaMAB2 korištena stabilna
transgenična linija uročnjaka koja eksprimira protein TaMAB2 obilježen privjeskom GFP
(TaMAB-GFP; Bauer i sur., 2019). Na sličan način, za istraživanje proteina BPM1, korištena je
transgenična linija uročnjaka koja prekomjerno eksprimira BPM1-GFP. Oba gena stabilno su
integrirana u genom i pod kontrolom su promotora virusa mozaika cvjetače 35S (eng. cauliflower
mosaic virus, CaMV 35S), osiguravajući konstitutivnu ekspresiju fuzijskog proteina.
Prethodna istraživanja ukazala su na uloge proteina MEL-26 i ZmMAB1 kao adaptera ligaze
CUL3-E3, u sklopu koje usmjeravaju ciljne proteine na razgradnju i tako sudjeluju u regulaciji
citoskeleta. Kako bi se provjerila potencijalna povezanost proteina TaMAB2 i regulacije funkcije
citoskeleta, provedena je analiza produžnog rasta korijena klijanaca uročnjaka s prekomjernom
ekspresijom TaMAB2. Duljina primarnog korijena transgeničnih klijanaca bila je ista kao kod
divljeg tipa, no duljina epidermalnih stanica korijena bila je statistički značajno veća kod
transgenične linije u odnosu na divlji tip, ukazujući na potencijalnu ulogu proteina TaMAB2 u
regulaciji funkcije citoskeleta. Nadalje, transgenični protoplasti s prekomjernom ekspresijom
proteina TaMAB2 analizirani su metodom Duolink te je utvrđena kolokalizacija proteina TaMAB2
s ubikvitinom u citoplazmatskim nakupinama, ukazujući na moguću uključenost proteina TaMAB2
u sastav ligaze CUL3-E3 ovisne o ubikvitinu. Ovi rezultati u skladu su s ranije pokazanom
lokalizacijom proteina TaMAB2 u citoplazmi i jezgri (Leljak-Levanić i sur., 2013) te zabilježenom
interakcijom između TaMAB2 i CUL3 (Bauer i sur., 2019). Sustavom dvaju kvaščevih hibrida
(eng. yeast two hybrid, Y2H) provjerena je interakcija između proteina TaMAB2 i citoskeletnog
regulatora Katanina iz pšenice, no zbog nespecifične interakcije u negativnoj kontroli, direktna
interakcija s Kataninom nije potvrđena. Koristeći transgeničnu liniju uročnjaka koja prekomjerno
eksprimira TaMAB2 prethodno je proveden eksperiment uzastopne afinitetne kromatografije i
spektrometrije masa (eng. tandem affinity purification-mass spectrometry, TAP-MS), te su
otkriveni potencijalni interaktori proteina TaMAB2, između ostalih, podjedinica A faktora
inicijacije translacije 4 i podjedinica G faktora inicijacije translacije 3 (Bauer i sur., 2019). Oba
proteina analizirana su u sustavu Y2H, no interakcija s proteinom TaMAB2 nije potvrđena.
Dosadašnja istraživanja opetovano su ukazivala na funkciju proteina BPM uročnjaka u odgovoru
na stres. S ciljem daljnje analize uloge proteina BPM1 u promijenjenim okolišnim uvjetima, biljke
divljeg tipa uročnjaka i/ili transgenične linije koje prekomjerno eksprimiraju protein BPM1
izložene su uvjetima suše, solnog stresa, povišenoj temperaturi te različitim uvjetima osvjetljenja,
te su potom analizirane različitim metodama. U divljem tipu je kvantitativnom metodom reverzne
transkripcije i lančane reakcije polimeraze (eng. quantitative reverse transcription polymerase
chain reaction, RT-qPCR) mjerena ekspresija svih šest gena BPM, dok je u transgeničnim linijama
hibridizacijom po Westernu mjerena stabilnost fuzijskog proteina BPM1-GFP, dok je njegova
unutarstanična lokalizacija analizirana fluorescencijskom mikroskopijom.
U svrhu induciranja solnog stresa, osmotskog stresa i signalne kaskade hormona ABA, biljke su
tretirane natrijevim kloridom, manitolom odnosno hormonom ABA. U divljem tipu, ovi tretmani
nisu uzrokovali značajnu promjenu u ekspresiji gena BPM, osim u slučaju gena BPM5, čija se
ekspresija smanjila nakon tretmana manitolom, i gena BPM6, čija je ekspresija porasla nakon
tretmana natrijevim kloridom. U transgeničnim linijama, razina proteina BPM1 nije se promijenila
nakon izlaganja osmotskom stresu i hormonu ABA, dok je tretman solnim stresom smanjio
količinu proteina BPM1, najvjerojatnije putem proteasomske degradacije. Nadalje, dok su
osmotski stres i ABA inducirali snažnu akumulaciju proteina BPM1 u jezgri stanica korijena, solni
stres je uzrokovao difuziju signala proteina BPM1 duž stele korijena. Osim toga, proveden je test
klijavosti divljeg tipa i transgeničnih linija na hranjivim podlogama s dodatkom natrijevog klorida,
manitola i hormona ABA. Test je pokazao da su transgenične linije otpornije od divljeg tipa na
osmotski stres i stres uzrokovan hormonom ABA. S druge strane, transgenične linije bile su
jednako podložne solnom stresu kao i divlji tip uročnjaka. Ovi rezultati ukazuju na potencijalnu
ulogu proteina BPM1 u odgovoru na sušu, no ne i na solni stres, pri čemu bi nakupljanje proteina
u jezgri i stabilna količina raspoloživog proteina mogle imati značajnu ulogu.
Radi provjere učinka povišene temperature na ekspresiju gena BPM te stabilnost i lokalizaciju
proteina BPM1, klijanci su inkubirani na 37 °C. U divljem tipu je nakon 3 sata tretmana zabilježen
porast ekspresije gena BPM1, BPM2 i BPM3, s najvećim povećanjem izmjerenim za gen BPM2.
Ekspresija gena BPM4 bila je blago smanjena, a gena BPM5 i BPM6 nepromijenjena. Nadalje,
količina proteina BPM1 značajno je porasla nakon 1 sat i 3 sata tretmana povišenom temperaturom,
a analiza korijena klijanaca ukazala je na njegovu snažnu akumulaciju u jezgrama epidermalnih
stanica nakon 6 sati tretmana. Ovi rezultati ukazuju da su u uvjetima povišene temperature, proteini
BPM, osim na razini genske ekspresije, regulirani i na post-translacijskoj razini, odnosno na razini
stabilnosti proteina. Porast genske ekspresije u divljem tipu te stabilizacija proteina u transgeničnoj
liniji ukazuju na nužnost povećane i stabilne razine raspoloživog proteina BPM1 u uvjetima
povišene temperature, što je u skladu s opisanom ulogom proteina BPM kao regulatora količine
transkripcijskog faktora DREB2A u sklopu odgovora na toplinski stres, radi sprječavanja mogućih
negativnih posljedica nakupljanja DREB2A (Morimoto i sur., 2017).
S ciljem provjere učinka prekomjerne ekspresije proteina BPM1 na količinu transkripcijskog
faktora DREB2A, napravljena je indirektna analiza ekspresije gena HsfA3 i AT4G36010, čiju
ekspresiju inducira DREB2A u uvjetima toplinskog stresa (Sakuma i sur., 2006b). Dok je u divljem
tipu uročnjaka izlaganje povišenoj temperaturi uzrokovalo očekivan porast ekspresije gena HsfA3
i AT4G36010, u transgeničnim linijama s prekomjernom ekspresijom proteina BPM1 taj je porast
bio značajno manji, ukazujući na smanjenu količinu aktivnog transkripcijskog aktivatora
DREB2A. Ovaj rezultat dodatno potvrđuje ulogu proteina BPM1 u degradaciji transkripcijskog
faktora DREB2A.
Za gen BPM2 zabilježen je najveći porast ekspresije u divljem tipu nakon izlaganja povišenoj
temperaturi. Gen BPM2 ujedno ima i najveći broj varijanti alternativnog prekrajanja RNA, koje
mogu dati pet različitih proteinskih produkata (BPM2.1 – BPM2.5). S ciljem provjere učinka
povišene i snižene temperature na alternativno prekrajanje gena BPM2, klijanci divljeg tipa
uročnjaka izloženi su 3 sata temperaturama 37 °C odnosno 4 °C te je metodom RT-qPCR mjerena
količina triju transkripata gena BPM2, točnije BPM2.3, BPM2.4 i BPM2.5. Dobiveni rezultati
ukazali su da je količina transkripta BPM2.5 značajno porasla nakon oba tretmana, ukazujući na
dominantnu ulogu ove proteinske varijante u oba tipa temperaturnog stresa. Nadalje, povišena
temperatura povećala je količinu transkripta BPM2.3, a smanjila količinu transkripta BPM2.4, dok
snižena temperatura nije imala značajnog utjecaja na količine ovih transkripata. Ovi rezultati
ukazuju na dodatnu razinu regulacije aktivnosti proteina BPM uslijed temperaturnog stresa, uz
regulaciju genske ekspresije i stabilnosti proteina, što potencijalno omogućava raznolikiji odgovor
biljaka na stres. Osim toga, varijanta BPM2.3, čija se količina povećava na povišenoj temperaturi,
ne sadrži potpunu domenu BTB, čime se otvara mogućnost dodatnih uloga proteina BPM u
odgovoru na stres, koje ne zahtijevaju interakciju s proteinom CUL3 posredovanu domenom BTB.
Količina svjetlosti je, kao i temperatura i količina dostupne vode, okolišni čimbenik koji oscilira s
obzirom na doba dana ili godine. S ciljem provjere učinka fotoperioda na ekspresiju gena BPM,
klijanci divljeg tipa uzgajani su u uvjetima dugog dana te su uzorkovani tijekom dana: u 12:00 i
17:00 te u 6:00 (kraj noćnog perioda). Ekspresija je analizirana metodom RT-qPCR. Za gene BPM2
i BPM6 pokazan je statistički značajan porast ekspresije na kraju noćnog perioda (6:00) u odnosu
na 12:00 i 17:00, dok je kod ostalih gena zabilježen sličan trend, ali bez statističke značajnosti.
Nadalje, klijanci transgenične linije uzorkovani su svaka 4 sata tijekom perioda od 24 sata i količina
proteina BPM1 analizirana je imunodetekcijom. Rezultati ove analize pokazali su da se količina
proteina BPM1 značajno smanjuje tijekom noći, ukazujući na smanjenu stabilnost i degradaciju
proteina. Konačno, s ciljem provjere unutarstanične lokalizacije proteina BPM1 nakon dugotrajnog
izlaganja svjetlosti odnosno mraku, klijanci transgenične linije analizirani su fluorescencijskom
mikroskopijom. Dok je produljeno izlaganje svjetlosti uzrokovalo karakteristično nakupljanje
proteina BPM1 u jezgrama epidermalnih stanica korijena, inkubacija u mraku dovela je do
disperzije signala proteina BPM1 te naposljetku do translokacije u stelu korijena. Ovi rezultati
ukazuju na regulaciju stabilnosti i unutarstanične lokalizacije proteina BPM1 ovisnu o fotoperiodu,
što je u skladu s ranijim indikacijama o ulozi proteina BPM u regulaciji cvjetanja, gdje fotoperiod
ima važnu ulogu (Chen i sur., 2015; Škiljaica i sur., 2020.)
S obzirom na utjecaj povišene temperature na ekspresiju gena iz obitelji BPM, posljednji cilj ovog
rada bio je odabir i validacija referentnih gena za normalizaciju vrijednosti ekspresije u metodi RTqPCR, u tkivima uročnjaka izloženima povišenoj temperaturi. Pregledom literature i javno
dostupnih pokusa DNA mikročipova (eng. microarray) na tkivima uročnjaka izloženima raznim
toplinskim tretmanima, odabrano je deset referentnih gena kandidata. Klijanci divljeg tipa
uročnjaka i odrasle biljke u fazi cvatnje tretirane su s pet različitih povišenih temperatura nakon
čega su uzorkovani čitavi klijanci, komadići listova i cvjetni pupovi. Ekspresija referentnih gena
kandidata mjerena je metodom RT-qPCR, nakon čega je stabilnost ekspresije analizirana pomoću
četiri različita programa za validaciju referentnih gena. U konačnici je provedena empirijska
validacija najstabilnijih gena u eksperimentu gdje je kao testni gen korišten DREB2A, a različite
kombinacije referentnih gena korištene su za normalizaciju podataka. Za svaku vrstu tkiva
predloženi su optimalni referentni geni za uporabu u analizama diferencijalne ekspresije gena
uročnjaka izloženog povišenim temperaturama. |
