Regulation of the activity of ubiquitin ligase HACE1

diplomski rad

• Naslov (hrvatski): Regulacija aktivnosti ubikvitinske ligaze HACE1
• Autor: Julia Jelena Toplak
• Mentor: Sonja Lorenz (mentor)
• Mentor: Dunja Leljak-Levanić (komentor)
• Član povjerenstva: Dunja Leljak-Levanić (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Biljana Balen (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Ivana Ivančić Baće (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Petra Peharec Štefanić (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prirodoslovno-matematički fakultet; (Biološki odsjek); Zagreb
• Datum i država obrane: 2023-09-21, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: PRIRODNE ZNANOSTI; Biologija

Sažetak

The HECT ubiquitin ligase HACE1 is involved in membrane dynamics regulation, mitophagy,
redox homeostasis, and cytoskeleton organization. Despite HACE1 being a tumor suppressor and
a significant factor in neural development, it remains biochemically poorly characterized, and its
regulatory mechanisms are not known. This master’s thesis explores the impact of phosphorylation
as a regulatory mechanism and its effect on HACE1 activity and dimerization. Phosphomimetic
variants were generated and characterized using functional assays, mass photometry, and analytical
size exclusion chromatography. The findings reveal that the phosphomimetic mutations within the
N-terminal helix disrupted dimerization and activated HACE1 activity, providing insights into how
the monomer could be stabilized in its active state. Furthermore, recombinantly purified kinases
PAK1 and TBK1 were investigated as potential regulators of HACE1 activity, and the sites targeted
by these kinases in HACE1 sites were identified through mass spectrometry.

Sažetak (hrvatski)

Ubikvitinska HECT ligaza HACE1 sudjeluje u regulacije dinamike membrana, mitofagiji, redokshomeostazi i organizaciji citoskeleta. Unatoč tome što je ligaza HACE1 tumor-supresor i značajan
faktor u razvoju živčanog sustava, nije detaljno biokemijski karakterizirana, a regulatorni
mehanizmi nisu poznati. Ovaj diplomski rad istražuje utjecaj fosforilacije kao regulatornog
mehanizma na aktivnost i dimerizaciju HACE1. Pripremljene su fosfomimetičke varijante i
karakterizirane korištenjem funkcionalnih eseja, masene fotometrije i analitičke kromatografije
temeljene na isključivanju. Rezultati otkrivaju da fosfomimetičke varijante unutar N-terminalnog
heliksa narušavaju dimerizaciju i aktiviraju aktivnost ligaze HACE1, pružajući uvid u to kako se
monomer može stabilizirati u aktivnom stanju. Nadalje, rekombinantno pročišćene kinaze PAK1 i
TBK1 istražene su kao potencijalni regulatori. Mjesta u ligazi HACE1 koje te kinaze ciljaju
identificirana su putem masene spektrometrije.

• Ključne riječi: ubiquitin ligase; HACE1; ubiquitylation; phosphorylation; HECT
• Ključne riječi (hrvatski): ubikvitin ligaza; HACE1; ubikvitilacija; fosforilacija
• Jezik: engleski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:217:358497
• Studijski program: Naziv: Molekularna biologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra molekularne biologije (mag. biol. mol.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Rad dostupan nakon; Datum isteka embarga: 2025-09-21
• Datum i vrijeme pohrane: 2023-10-25 10:22:08