Konstrukcija epigenetičkoga CRISPR/Cas9 sustava za ciljanu metilaciju specifičnih CpG mjesta

disertacija

• Naslov (engleski): Development of epigenetic CRISPR/Cas9 system for targeted methylation at specific CpG sites
• Autor: Paula Dobrinić
• Mentor: Vlatka Zoldoš (mentor)
• Član povjerenstva: Aleksandar Vojta (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Maja Matulić (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Srećko Gajović (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prirodoslovno-matematički fakultet; (Biološki odsjek); Zagreb
• Datum i država obrane: 2016, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: PRIRODNE ZNANOSTI; Biologija
• Univerzalna decimalna klasifikacija (UDC): 57 - Biološke znanosti. Fizička antropologija. Bioraznolikost

Sažetak

Metilacija DNA važan je epigenetički mehanizam uključen u regulaciju aktivnosti genoma i normalan razvoj sisavaca. Metilacija CpG mjesta unutar regulatornih regija gena najčešće se povezuje s njihovim utišavanjem, no mehanizmi iza utvrđene korelacije nisu u potpunosti razjašnjeni. Precizne funkcionalne studije ograničene su nedostatkom metoda za ciljanu promjenu metilacijskih oznaka. U tu sam svrhu razvila fleksibilni molekularni alat za ciljanu metilaciju CpG mjesta unutar genomskog područja od interesa, temeljen na sustavu CRISPR/Cas9. Konstruirala sam fuzijski protein koji kombinira sposobnost vezanja specifične sekvence DNA s metiltransferaznom aktivnošću enzima DNMT3A. Konstruirani alat je u ljudskim stanicama u kulturi inducirao značajnu hipermetilaciju ciljanih CpG mjesta unutar promotora kandidat gena što je rezultiralo utišavanjem transkripcije istih. Uspostavljeni uzorak metilacije ovisi o mjestu vezanja i orijentaciji pridružene molekule RNA komplementarne ciljanom lokusu. Opisana metoda ima veliki potencijal u rasvjetljavanju uzročno-posljedične veze između metilacije DNA i regulacije ekspresije gena

Sažetak (engleski)

DNA methylation is an important epigenetic mechanism involved in genome regulation and normal development in mammals. CpG methylation of regulatory regions is usually associated with gene silencing, but exact mechanisms underlying this correlation are still unknown. Precise functional studies have been limited due to the lack of methods for targeted manipulation of methylation marks. To that end, I developed a flexible CRISPR/Cas9-based tool for targeted methylation of specific CpG sites. The programmable DNA binding module and DNA methyltransferase activity of DNMT3A were combined into a single fusion protein. Significant hypermethylation of targeted CpG sites at promoters of candidate genes was induced in human cultured cells, which resulted in gene transcriptional silencing. The established methylation profile was dependent on the associated complementary guide RNA. The described epigenetic tool could be very useful for precise interrogation of the causal relationship between DNA methylation and gene regulation.

• Ključne riječi: metilacija DNA; epigenetička regulacija; sustav CRISPR/Cas9; epigenetički inženjering; utišavanje gena
• Ključne riječi (engleski): DNA methylation; epigenetic regulation; CRISPR/Cas9 system; epigenetic editing; gene silencing
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:217:149384
• Studijski program: Naziv: Biologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: poslijediplomski doktorski; Akademski / stručni naziv: doktor/doktorica znanosti, područje prirodnih znanosti, polje biologija (dr.sc.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup
• Datum i vrijeme pohrane: 2017-05-12 10:04:49