EFFECTS OF SIMULTANEOUS MANIPULATION OF DNA AND HISTONES ON THE EXPRESSION OF GENES INVOLVED IN EPITHELIAL-MESENCHYMAL TRANSITION USING CRISPR/dCas9 SYSTEM

doktorski rad

• Naslov (hrvatski): UTJECAJ ISTOVREMENE MANIPULACIJE DNA I HISTONA NA EKSPRESIJU GENA UKLJUČENIH U EPITELNO-MEZENHIMSKU TRANZICIJU PRIMJENOM SUSTAVA CRISPR/dCas9
• Autor: Nika Foglar
• Mentor: Vlatka Zoldoš (mentor)
• Član povjerenstva: Nataša Bauer (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Rosa Karlić (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Oliver Vugrek (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prirodoslovno-matematički fakultet; (Biološki odsjek); Zagreb
• Datum i država obrane: 2024-03-21, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: PRIRODNE ZNANOSTI; Biologija
• Univerzalna decimalna klasifikacija (UDC): 577 - Biokemija. Molekularna biologija. Biofizika

Sažetak

Interplay between epigenetic modifications is essential for regulation of gene expression.
The adaptation of CRISPR/Cas9 technology for epigenetic research by introducing dead Cas9
(dCas9) fused to epigenetic effector domains (ED) has enabled significant advancements in this
field. I expanded the CRISPR/dCas9 modular system with five histone modifying domains
(G9a, G9a-me3, LSD1, KDM5A, macro1.1) and DNMT3L domain, as well as the multi-guide
module to accommodate up to 11 gRNAs. From a set of candidate genes involved in epithelial
to mesenchymal transition (EMT), ZEB1 and SNAI1 were selected for further epigenetic
manipulations in HepG2 cell line. Their CpG islands were simultaneously targeted with dCas-
DNMT3A combined with specific dCas9-ED fusions to understand the interplay of DNA
methylation and histone modifications. The combinations had synergistic effect on gene
expression and affected the EMT phenotype. Interplay between introduced modifications was
also observed as a locus specific synergistic increase in DNA methylation, and was not
disrupted by global histone acetylation increase after sodium butyrate treatment. The
combinatorial epigenetic effects were not replicated in A549 cell line, suggesting specificity of
epigenetic regulatory pathways.

Sažetak (hrvatski)

Međudjelovanje epigenetičkih modifikacija je neophodno regulaciju ekspresije gena.
Korištenje CRISPR/Cas9 tehnologije u epigenetičkim istraživanjima pomoću inaktivnog Cas9
(dCas9) fuzioniranog s epigenetičkim efektorskim domenama (ED) omogućilo je značajan
napredak u ovom području. Proširila sam modularni sustav CRISPR/dCas9 s pet domena za
modifikaciju histona (G9a, G9a-me3, LSD1, KDM5A, makro1.1) i domenom DNMT3L, te
„multi-guide“ modul koji može primiti do 11 gRNA. Od nekoliko kandidat gena koji sudjeluju
u epitelno-mezenhimskoj tranziciji (EMT), odabrala sam ZEB1 i SNAI1 za daljnje epigenetičke
manipulacije u staničnoj liniji HepG2. Njihovi CpG otoci su istovremeno ciljani s DNMT3AdCas9
u kombinaciji s određenom dCas9-ED fuzijom kako bi se istražilo među-djelovanje
DNA metilacije i modifikacija histona. Kombinacije su imale sinergistički učinak na ekspresiju
gena i utjecale su na EMT fenotip. Simultano uvedene modifikacije pokazale su sinergistički
efekt na razini metilacije DNA na određenom lokusu, koji nije bio osjetljiv na povećanje
globalne acetilacije histona. Kombinacije dCas9 fuzija nisu djelovale na ekspresiju ciljanih
gena u A549 staničnoj liniji, što ukazuje na specifičnost epigenetičkih regulatornih putova.

• Ključne riječi: DNA methylation; histone modifications; epigenetic crosstalk; CRISPR/dCas9 epigenetic engineering; CpG island; EMT
• Ključne riječi (hrvatski): metilacija DNA; histonske oznake; epigenetičke interakcije; CRISPR/dCas9 epigenetičko inženjerstvo; CpG otok; EMT
• Jezik: engleski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:217:444849
• Datum promocije: 2024
• Projekt: Šifra: KK.01.1.1.04.0085; Naziv: Genomsko inženjerstvo i genska regulacija u staničnim linijama i modelnim organizacijama tehnologija CRISPR / Cas9 CasMouse; Naziv: Genomic engineering and gene regulation in the cell lines model organisms CRISPR / Cas9 CasMouse technology; Kratica: CRISPR/Cas9-CasMouse; Voditelj: Vlatka Zoldoš; Pravna nadležnost: Hrvatska; Financijer: EK; Linija financiranja: EFRR
• Studijski program: Naziv: Biologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: doktorski studij; Akademski / stručni naziv: doktor/doktorica znanosti u području prirodnih znanosti (dr. sc. natur.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Rad dostupan nakon; Datum isteka embarga: 2026-03-21
• Datum i vrijeme pohrane: 2024-04-02 10:13:19