Uloge nukleaza DnaQ, ExoT i helikaze UvrD u naivnoj adaptaciji sustava CRISPR-Cas u bakteriji Escherichia coli

diplomski rad

• Naslov (engleski): The roles of DnaQ, ExoT nucleases and UvrD helicase in CRISPR-Cas system naive adaptation in Escherichia coli
• Autor: Tomislav Mamić
• Mentor: Ivana Ivančić Baće (mentor)
• Član povjerenstva: Ivana Ivančić Baće (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Tomislav Ivanković (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Petra Peharec Štefanić (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Dijana Škorić (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prirodoslovno-matematički fakultet; (Biološki odsjek); Zagreb
• Datum i država obrane: 2023-09-18, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: PRIRODNE ZNANOSTI; Biologija

Sažetak

Sustav CRISPR-Cas prokariotski je sustav adaptivne imunosti. Sastoji se od gena cas, koji
sudjeluju u svim fazama obrane, te lokusa CRISPR, u kojemu se nalaze ponavljajuće regije
isprekidane razmaknicama podrijetlom iz strane DNA. Tijekom faze adaptacije razmaknica se
ugrađuje u lokus CRISPR, a predmet ovog istraživanja jest naivna adaptacija koja se zbiva pri
prvom susretu stanice sa stranom DNA. Glavnu ulogu u naivnoj adaptaciji imaju proteini
Cas1 i Cas2 koji tvore integracijski kompleks, no da bi strana DNA postala supstratom
kompleksa, podvrgava se helikaznoj i egzonukleaznoj aktivnosti enzima RecBCD.
Odnedavno je poznato da egzonukleazna aktivnost enzima RecBCD nije nužna za odvijanje
tog procesa. Ovdje, prvi put je istražena uloga egzonukleaza DnaQ i ExoT u naivnoj
adaptaciji u uvjetima in vivo u bakteriji Escherichia coli. U tu svrhu, metodom
recombineering konstruirani su mutanti ΔdnaQ i ΔexoT te transformirani plazmidom s genima
cas1-cas2. Ugradnja razmaknice analizirana je metodom PCR. Dobiveni rezultati ukazuju da
DnaQ djelomično sudjeluje u procesiranju te da ExoT vjerojatno ne sudjeluje i može biti
zamijenjena drugim nukleazama. Jednako, prvi put u kontekstu adaptacije, istražena je uloga
helikaze UvrD, na mutantu ΔuvrD, a rezultati upućuju da UvrD potiče naivnu adaptaciju,
možebitno uklanjanjem proteina RecA s jednolančanih supstrata.

Sažetak (engleski)

CRISPR-Cas system is a prokaryotic adaptive immunity system that consists of cas genes,
which participate in all phases of defense, and the CRISPR locus with series of repeats
interspaced by spacers originating from foreign DNA. During the adaptation phase, a spacer is
integrated into the CRISPR locus. The objective of this study is naive adaptation, occurring
during the cell's initial contact with foreign DNA. The primary role in naive adaptation is
mediated by the Cas1 and Cas2 proteins, which form an integration complex. However, in
order for foreign DNA to become an integration complex's substrate, it is subjected to the
helicase and exonuclease activities of the RecBCD enzyme. Recently, it has been discovered
that the exonuclease activity of the RecBCD enzyme is not essential for this process. Here, for
the first time, the role of DnaQ and ExoT exonucleases in naive adaptation was studied in vivo
in E. coli. For that purpose, ΔdnaQ and ΔexoT mutants were constructed using
recombineering and transformed with a plasmid carrying the cas1-cas2 genes. Spacer
acquisition was analyzed using the PCR method. The obtained results indicate that DnaQ
partially participates in processing, and that ExoT likely doesn't participate and can be
replaced by other nucleases.. Similarly, for the first time in the context of adaptation, the role
of the UvrD helicase was studied using ΔuvrD mutant. The results suggest that UvrD
promotes naive adaptation, possibly by removing the RecA protein from single-stranded
substrates.

• Ključne riječi: razmaknica; egzonukleaza; procesiranje; Cas1-Cas2; RecBCD; RecA
• Ključne riječi (engleski): spacer; exonuclease; processing; Cas1-Cas2; RecBCD; RecA
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:217:944431
• Studijski program: Naziv: Molekularna biologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: sveučilišni/a magistar/magistra molekularne biologije (univ. mag. biol. mol.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup; Datum isteka embarga: 2024-09-18
• Datum i vrijeme pohrane: 2024-09-16 16:09:13