Konstrukcija mutiranog protonskog izmjenjivača NHE3 i njegova funkcija

diplomski rad

• Naslov (engleski): Construction of the mutated NHE3 proton exchanger and his function
• Autor: Dora Brauneger
• Mentor: Mirza Žižak (mentor)
• Mentor: Nataša Bauer (mentor)
• Član povjerenstva: Nataša Bauer (predsjednik povjerenstva)
• Član povjerenstva: Mirta Tkalec (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Ana Galov (član povjerenstva)
• Član povjerenstva: Petar Kružić (član povjerenstva)
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Prirodoslovno-matematički fakultet; (Biološki odsjek); Zagreb
• Datum i država obrane: 2015-02-27, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: PRIRODNE ZNANOSTI; Biologija

Sažetak

Tema ovog rada bila je stvoriti mutirani transmembranski proteinski izmjenjivač Na+/H+ izooblik 3 (NHE3). Postupkom delecije uklonjene su 24 aminokiseline (Leu 586 – Arg609) važne za vezanje pojedinih stimulatora i inhibitora aktivnosti proteina NHE3 koji sudjeluje u održavanju homeostaze pH stanica. Delecija je provedena pomoću lančane reakcije polimerazom (PCR) metodom preklapanja dvaju fragmenta DNA sekvence gena NHE3. Predložak je bio plazmid pcDNA 3.1(+) s prethodno ugrađenom cDNA sekvencom gena HA-NHE3 (pcDNA/HA-NHE3). Uspješnost delecija provjerena je usporedbom dobivenog mutiranog fragmenta AD s kontrolnim fragmentom bez delecije. Fragment AD i plazmid pcDNA/HA-NHE3 tretirani su restrikcijskim enzimom PmaCI koji sekvencu NHE3 cijepa na dva mjesta. Pocijepani plazmid pcDNA/HA-NHE3 i fragment AD spojeni su ligazom i kao rezultat dobiven je plazmid s mutiranom sekvencom gena NHE3, pcDNA/dHA-NHE3. Produkt ligacije transformirao je bakterijske stanice Escherichia coli soja DH5α. Iz izraslih kolonija izoliran je plazmid pcDNA/dHA-NHE3 i pomoću restrikcijskih enzima HindIII i KpnI dokazana je uspješnost ligacije i pravilna orijentacija umetnutog fragmenta AD. Reakcijom PCR dokazana je uspješnost mutacije pomoću negativne početnice koja se veže za deletiran dio unutar gena NHE3. Konačna potvrda postojanja delecije je sekvenciranje dobivenog plazmida. Plazmidom pcDNA/dHA-NHE3 transficirane su stanične linije fibroblasta PS120. Postupkom zakiseljavanja medija dokazana je funkcionalnost proteina NHE3 unatoč mutaciji što bi značilo da unutar sekvence NHE3 postoji više regulacijskih mjesta aktivnosti proteina NHE3, zasebno ili u interakciji.

Sažetak (engleski)

The subject of this thesis was the construction of a mutated transmembrane isoform 3 Na+/H+ protein exchanger (NHE3). 24 amino acids deleted (Leu 586 – Arg609) are crucial for NHE3 protein regulation. The role of this exchanger is maintaining the homeostasis of cellular pH, by certain stimulators or inhibitors. The deletion has been accomplished by standard polymerase chain reaction method (PCR) using fragments of NHE3 sequence with flanking ends. The template for the reaction was pcDNA 3.1(+) plasmid with an inserted HA-NHE3 cDNA sequence (pcDNA/HA-NHE3). The efficacy of the deletion was checked by comparing the mutated fragment AD with control, unmutated fragment. After that, both pcDNA/HA-NHE3 plasmid and fragment AD were treated with PmaCI restriction enzyme having two restriction sites within the NHE3 sequence. Then, using the products of the reaction and treating them with ligase, a plasmid with a mutated NHE3 sequence was constructed, pcDNA/dHA-NHE3. Escherichia coli, DH5μ were transformed with ligation product and pcDNA/dHA-NHE3 plasmid was isolated from transformed colonies. The efficacy of the ligation and the proper orientation of the insert were examend by restriction analysis. The efficacy of the mutation was shown by PCR reaction using an anti-sense primer annealing to the deleted amino acid sequence. The final confirmation of the deletion was the sequencing of the isolated plasmid. A fibroblast PS120 cell line was transformed by pcDNA/dHA-NHE3 plasmid and the functionality of the NHE3 protein was shown by acid loading. The mutated protein was functional, leading to the conclusion that the protein contains several regulation sequences, separate or together.

• Ključne riječi: NHE3; kloniranje
• Ključne riječi (engleski): NHE3; cloning
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:217:235476
• Studijski program: Naziv: Eksperimentalna biologija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra eksperimentalne biologije (mag. biol. exp.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup
• Datum i vrijeme pohrane: 2017-04-21 08:26:09