| Abstract | Urođeni poremećaji glikozilacije (CDGs) skupina su autosomno recesivnih poremećaja karakteriziranih disfunkcijom središnjeg živčanog sustava i rada mnogih organa. Poremećaji su uzrokovani abnormalnom glikozilacijom glikoproteina, povezanom s mutacijama u genima uključenim u N-glikozilacijske puteve. CDG tip I uključuje defekte u sastavljanju lipid-vezanog oligosaharidnog prekursora i/ili u njegovom prijenosu na protein. CDG-Ia, najčešći tip CDG-I, uzrokovan je deficijencijom enzima fosfomanomutaze 2 (PMM2) kojeg eksprimira gen PMM2. PMM2 izomerizira manoza-6-fosfat u manoza-1-fosfat koja prelaskom u GDP-manozu postaje donor za sintezu lipid-vezanog oligosaharidnog prekursora. Najčešća točkasta mutacija u egzonu 5 gena PMM2 koja uzrokuje CDG-Ia je c.422G>A, odnosno aminokiselinska zamjena R141H. U ovom je radu analizirana učestalost mutacije R141H u egzonu 5 i polimorfizama jednog nukleotida (eng. single nucleotide polymorphisms, SNPs) (IVS5+19T/C, IVS5+22T/A, IVS4-58-56delATG) u dijelovima intronskih sljedova pripadajućih egzonu 5 gena PMM2 na 60 uzoraka humane genomske DNA (gDNA). Cilj rada bio je odrediti učestalost pojavnosti nositelja mutacije R141H u ovom uzorku hrvatske populacije, kao i učestalost pojave nositelja polimorfizama jednog nukleotida u dijelovima intronskih sljedova IVS4 i IVS5 pripadajućih egzonu 5. Istraživanja su pokazala da su ti polimorfizmi povezani sa specifičnim mutacijama koje uzrokuju CDG-Ia. Nakon izolacije humane gDNA iz pune krvi metodom Chelex®, ciljni slijed DNA veličine 291 pb (egzon 5 sa dijelovima pripadajućih intronskih sljedova IVS4 i IVS5 u genu PMM2) umnožen je PCR reakcijom, a PCR produkti vizualizirani su etidij bromidom na agaroznoj gel elektroforezi. Prisutnost mutacija/polimorfizama ispitana je analizom polimorfizama konformacije jednolančane DNA (eng. single-strand conformation polymorphism, SSCP), a vrpce jednolančane DNA (ssDNA) vizualizirane su bojanjem gela srebrom. Svaki uzorak čije su vrpce ssDNA na gelu pokazale drukčiji SSCP elektroforetski obrazac u usporedbi s divljim tipom i kontrolom (poznati CDG-Ia), sekvenciran je te mu je određen slijed nukleotida na uređaju ABI Prism 310 Genetic Analyzer. Rezultati rada pokazali su da u 60 analiziranih uzoraka humane gDNA nema mutacije R141H u genu PMM2, odnosno da u ovom uzorku hrvatske populacije nema nositelja te mutacije (heterozigota za R141H). Sedam uzoraka pokazalo je promijenjeni SSCP elektroforetski obrazac, različit od DNA divljeg tipa i kontrolne DNA: u pet uzoraka utvrđena je prisutnost heterozigotnog oblika polimorfizma IVS5+19T/C, te su utvrđeni nositelj heterozigotnog oblika polimorfizma IVS4-58-56delATG (1) i nositelj heterozigotnog oblika polimorfizma IVS5+22T/A (1). Na temelju ovih rezultata može se zaključiti da iako nisu utvrđeni nositelji mutacije R141H, ne može se izvesti općeniti zaključak o učestalosti ove mutacije u hrvatskoj populaciji, budući je istraživanje provedeno na malom broju uzoraka. Rezultati se slažu sa činjenicom da u Republici Hrvatskoj nema utvrđenih osoba oboljelih od CDG-Ia. Također se može zaključiti da je ovaj uzorak hrvatske populacije specifičan što se tiče ispitivanih mutacija/polimorfizama u odnosu na neke druge populacije, no kako bi se donio konačan zaključak potrebno je analizirati veći broj uzoraka bolesnika koji su oboljeli od bolesti čiji simptomi odgovaraju simptomima koji se javljaju u CDG-Ia. |
| Abstract (english) | Congenital disorders of glycosylation (CDGs) are autosomal recessive disorders characterized by central nervous system dysfunction and multiorgan failure due to aberrant N-glycosylation of glycoproteins. CDG type I consist of defects in the assembly of lipid-linked oligosaccharide precursor and/or its transfer to the polypeptide chain. CDG-Ia, the most prevalent CDG-I, is caused by deficiency of phosphomannomutase 2 (PMM2), which is associated with mutations in PMM2 gene. PMM2 converts mannose 6-phosphate to mannose 1-phosphate, which then serves as GDP-mannose donor for the synthesis of lipid-linked oligosaccharide precursor. The R141H mutation (c.422G>A) is the most frequent mutation in exon 5 of PMM2 gene, accounting for low PMM2 activity. In this work, the allele frequencies of R141H mutation in exon 5 and single nucleotide polymorphisms (SNP) (IVS5+19T/C, IVS5+22T/A, IVS4-58-56delATG) in parts of introns related to exon 5 were studied on 60 samples of human genomic DNA (gDNA). The main goal was to determine the frequency of R141H heterozygotes in this sample of Croatian population, and also the frequency of polymorphisms in parts of intronic sequences IVS4 and IVS5 related to exon 5. Studies have shown that these polymorphisms are commonly related to specific mutations which cause CDG-Ia. After human genomic DNA was isolated from whole blood using Chelex® protocol, the target 291 bp DNA fragment (exon 5 of PMM2 gene and parts of its associated intronic sequences IVS4 and IVS5) was amplified using the PCR method and the resulting DNA bands were visualized by ethidium bromide on agarose gel. The mutation/polymorphism screening was preformed using the single-strand conformation polymorphism (SSCP) analyses; single-stranded DNA (ssDNA) bands were visualized by silver staining. Every ssDNA that showed different SSCP electrophoretic pattern compared to wild type ssDNA and control (known CDG-Ia) was sequenced and then analyzed using ABI Prism 310 Genetic Analyzer. The results of the analyses showed that in 60 analyzed human gDNA samples no R141H mutation in PMM2 gene was found, that means that no R141H heterozygotes were found in this sample of Croatian population. Seven samples showed polymorphisms in parts of intronic sequences (IVS4, IVS5) related to exon 5 of PMM2 gene: five IVS5+19T/C polymorphisms, one IVS4-58-56delATG and one IVS5+22T/A polymorphism were detected. However, we cannot make a general conclusion about the presence of R141H mutation in this population because of the limited number of samples. Nevertheless, the result complies with the fact that so far no CDG-Ia patients are found in Republic of Croatia. We can also make a conclusion that this sample of Croatian population is specific considering analyzed mutation/polymorphisms compared to some other populations, but to make a general conclusion it is necessary to analyze a larger set of samples from patients with disease having similar symptoms to those found in CDG-Ia patients. |
